FOLDIT

Έργο

Ανάπτυξη ερευνητικής υποδομής στο Ιόνιο Πανεπιστήμιο για τη μελέτη αναδίπλωσης πρωτεϊνών στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες (FOLDIT)

Σύντομη περιγραφή

Οι πρωτεΐνες παίζουν σημαντικό ρόλο σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες. Η λειτουργία τους καθορίζεται από την αλληλουχία των αμινοξέων αλλά και τη σωστή αναδίπλωσή τους κατά το σχηματισμό της τριτοταγούς τους δομής. Αν οι πρωτεΐνες δεν λάβουν την κατάλληλη διαμόρφωση μπορεί να σχηματίσουν αφενός επιφάνειες που παρεμποδίζουν τη φυσιολογική σύνδεση με άλλα βιομόρια, αφετέρου δημιουργούν συσσωματώματα τα οποία είναι ιδιαίτερα τοξικά για τον οργανισμό. Αυτά τα συσσωματώματα αποτελούν κοινό γνώρισμα πολλών νευροεκφυλιστικών ασθενειών, όπως τα ινίδια αμυλοειδούς στη νόσο Alzheimer λόγω εναποθέσεων β-αμυλοειδούς, α-συνουκλεϊνης στη νόσο Πάρκινσον και prions στην Creutzfeldt–Jakob. Στόχος του παρόντος έργου αποτελεί η ανίχνευση και η μελέτη της αναδίπλωσης χαρακτηριστικών πρωτεϊνικών μοτίβων που εμπλέκονται στους μηχανισμούς εκδήλωσης νευροεκφυλιστικών ασθενειών μέσω εξειδικευμένων πειραματικών διατάξεων όπως η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων και κατάλληλων υπολογιστικών προσεγγίσεων. Η μέχρι σήμερα ελλιπής κατανόηση αναφορικά με τον τρόπο που οι πρωτεΐνες αναδιπλώνονται στο χώρο και αλληλοεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες του κυττάρου αποτελούν ένα στοίχημα για την ερευνητική κοινότητα. Επιμέρους στόχοι του έργου αποτελούν η απεικόνιση των μορφολογικών χαρακτηριστικών και της χωρικής κατανομής των πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων σε συνάρτηση με το χρόνο ενώ ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στο ελάχιστο χρονικό πλαίσιο που απαιτείται για την απεικόνιση των πρωτεϊνικών μοτίβων συσσωμάτωσης.

Σκοπός

Στα πλαίσια του παρόντος έργου θα πραγματοποιηθούν μελέτες ελέγχου μοτίβων πρωτεϊνικής αναδίπλωσης σε επιλεγμένες πρωτεΐνες-στόχους για εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων ως προς το ρόλο της ελαττωματικής αναδίπλωσης και σχηματισμού συσσωματωμάτων. Η επιλογή των πρωτεϊνών θα γίνει βάσει κατάλληλων κριτηρίων (αμινοξική αλληλουχία, περιοχή φωσφορυλίωσης) ενώ για την ανάλυση των αποτελεσμάτων και την ερμηνεία των δεδομένων θα εφαρμοστούν κατάλληλα λογισμικά επεξεργασίας. Η πρωτοτυπία της μελέτης έγκειται σε γεγονός ότι θα πραγματοποιηθεί με τη χρήση εξειδικευμένης πειραματικής μεθοδολογίας όπως η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων η οποία δύναται να καταστήσει εφικτή την παρατήρηση χρονοεξαρτώμενης συσσωμάτωσης πρωτεϊνικών μορίων σε επαφή με δύο μοντέλα στερεών επιφανειών και την εξαγωγή επιμέρους κινητικών παραμέτρων. Το μικροσκόπιο ατομικής δύναμης ForceRobot® 300 (JPK BioAFM Bruker, Germany) που θα χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια του έργου αποτελεί μία πλήρως αυτοματοποιημένη πειραματική διάταξη για διεξαγωγή δυναμικής φασματοσκοπίας που επιτρέπει την απεικόνιση και μελέτη της βραχύβιας αναδίπλωσης και αποδιάταξης μεμονωμένων βιολογικών μακρομορίων. Στους στόχους του έργου FOLDIT περιλαμβάνονται:

Στόχος 1: Εγκατάσταση, λειτουργία και παραμετροποίηση εξοπλισμού – Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης και Δυναμική Φασματοσκοπία για τη διεξαγωγή πειραμάτων που αφορούν την λανθασμένη αναδίπλωση πρωτεϊνών.

Στόχος 2: Εκπαίδευση του προσωπικού για τη χρήση του εξοπλισμού.

Στόχος 3: Συλλογή δεδομένων ασθενών και εξαγωγή δεδομένων με χρήση του εξοπλισμού

Στόχος 4: Ανάλυση των αποτελεσμάτων και διαχείριση των εξαγόμενων ερευνητικών αποτελεσμάτων σχετικά με ιδιότητες και κινητικές παραμέτρους αποδιάταξης, το ρόλος της ελαττωματικής αναδίπλωσης πρωτεϊνών και των συσσωματωμάτων τους στις πρωτεϊνοπάθειες, θεραπευτικούς στόχους, μεταφραστική έρευνα και σε κλινικές δοκιμές για ασθένειες που σχετίζονται με πρωτεΐνες με ελαττωματική αναδίπλωση

Στόχος 5: Μελέτη σκοπιμότητας και σχεδιασμός βιωσιμότητας για μακροχρόνια χρήση του εξοπλισμού, συμπεριλαμβανομένων των πολιτικών χρήσης

Εγκατάσταση εξοπλισμού, παραμετροποίηση, λειτουργία και εκπαίδευση

Η 1^η ενότητα εργασίας (ΕΕ1) περιλαμβάνει την προμήθεια του απαραίτητου εξοπλισμού (ForceRobot®300) στο Εργαστήριο Βιοπληροφορικής και Ανθρώπινης Ηλεκτροφυσιολογίας του Τμήματος Πληροφορικής του Ιονίου Πανεπιστημίου. Θα γίνουν τα απαραίτητα βήματα για την εγκατάσταση του εξοπλισμού στο εργαστήριο, την παραμετροποίηση του και τον έλεγχο της λειτουργικότητας. Επιπλέον, σε αυτό το πακέτο εργασίας θα πραγματοποιηθεί η εκπαίδευση του προσωπικού του εργαστηρίου για τη λειτουργία του εξοπλισμού από το προσωπικό της προμηθεύτριας εταιρείας.

Έγκριση μελέτης, συλλογή δεδομένων και διεξαγωγή πειραμάτων

Η 2^η ενότητα εργασίας (ΕΕ2) περιλαμβάνει την έγκριση μελέτης για ανάλυση επιλεγμένων πρωτεϊνών-στόχων μέσω του εξειδικευμένου εξοπλισμού. Το μικροσκόπιο ατομικών δυνάμεων επιτρέπει την απεικόνιση και την ανίχνευση των αλληλεπιδράσεων μεμονωμένων μορίων και τη διερεύνηση των εσωτερικών μοριακών ιδιοτήτων όπως η ελαστικότητα της δομής τους κατά την απώλεια της τριτοταγούς δομής τους. Μπορούν επίσης να διερευνηθούν οι κινητικές παράμετροι της ελαττωματικής αναδίπλωσης κατά την αλληλεπίδραση των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων και να γίνει κατανοητή η διαφοροποίηση μεταξύ προσδέτη και αναστολέα μεταβάλλοντας συγκεκριμένες πειραματικές παραμέτρους.

Ανάλυση των αποτελεσμάτων σχετικά με την λανθασμένη αναδίπλωση των πρωτεϊνών

Η 3^η ενότητα εργασίας (ΕΕ3) περιλαμβάνει μεθοδολογίες ανάλυσης των δεδομένων που θα προέλθουν από την ΕΕ2 χρησιμοποιώντας τεχνικές στατιστικής και εξόρυξης δεδομένων για την αντιμετώπιση των βασικών ερευνητικών ερωτημάτων σχετικά με την ελαττωματική αναδίπλωση των πρωτεϊνών και τη συσχέτισή τους με νευροεκφυλιστικά νοσήματα όπως επίδραση pH στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών, καμπύλες απόστασης ισχύος με ενιαία ρήξη, καμπύλες απόστασης ισχύος με μοτίβο πολλαπλής ρήξης, παράμετροι συσσώρευσης, στόχευση της ελαττωματικής αναδίπλωσης.

Μελέτη σκοπιμότητας και σχεδιασμός βιωσιμότητας για μακροχρόνια χρήση του εξοπλισμού, συμπεριλαμβανομένων των πολιτικών χρήσης

Η 4^η ενότητα εργασίας (ΕΕ4) περιλαμβάνει τον έλεγχο της σκοπιμότητας και τη βιωσιμότητα της ερευνητικής υποδομής μετά το πέρας της χρηματοδότησης και να καθορίσει τις πολιτικές χρήσης. Η μελέτη βιωσιμότητας θα αναδείξει τρόπους έτσι ώστε τα αποτελέσματα της ερευνητικής δραστηριότητας να χρησιμοποιηθούν από άλλους φορείς ενώ ως προς τις πολιτικές χρήσεις θα γίνει μελέτη προσβασιμότητας της ερευνητικής υποδομής στο ευρύ κοινό, καθώς και πλάνο ενσωμάτωσης της ερευνητικής υποδομής σε μεγάλα Ευρωπαϊκά και Διεθνή Δίκτυα Ερευνητικού Εξοπλισμού.

Εξοπλισμός

Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης – Δυναμικής Φασματοσκοπίας στο Εργαστήριο Βιοπληροφορικής και Ανθρώπινης Ηλεκτροφυσιολογίας του τμήματος Πληροφορικής του Ιονίου Πανεπιστημίου.

Ενότητα εργασίας 1

Π1.1 Εγκατάσταση και λειτουργία του εξοπλισμού.
Π1.2 Υλικό και δραστηριότητες κατάρτισης

Ενότητα εργασίας 2

.Π2.2.1 Έγκριση μελέτης
Π2.2.2 Έκθεση σχετικά με τη συλλογή δεδομένων και την αναδίπλωση των πρωτεϊνών

Ενότητα εργασίας 3

Π 3.1 Τίτλος: Δημοσίευση σε επιστημονικό συνέδριο 1
(με αντικείμενο βιολογίας / βιοχημείας)
Π 3.2 Δημοσίευση σε επιστημονικό συνέδριο 2
(συνέδριο πληροφορικής)
Π 3.3 Δημοσίευση σε επιστημονικό συνέδριο 3.
(κλινικό / ιατρικό συνέδριο)
Π 3.4 Δημοσίευση σε επιστημονικό περιοδικό 2
(με αντικείμενο βιολογίας / βιοχημείας)
Π 3.5 Δημοσίευση σε επιστημονικό περιοδικό 2
(με αντικείμενο βιοπληροφορικής)
Π 3.6 Τεχνική έκθεση αποτελεσμάτων ανάλυσης

Ενότητα εργασίας 4

.Π4.1 Μελέτη σκοπιμότητας
Π4.2 Σχέδιο βιώσιμης ανάπτυξης
Π4.3 Πολιτική χρήσης

Ενότητα εργασίας 1

Π1.1 Εγκατάσταση και λειτουργία του εξοπλισμού
Π1.2 Υλικό και δραστηριότητες κατάρτισης

Ενότητα εργασίας 2

Π2.2.1 Έγκριση μελέτης
Π2.2.2 Έκθεση σχετικά με τη συλλογή δεδομένων και την αναδίπλωση των πρωτεϊνών

Ενότητα εργασίας 3

Π 3.1 Τίτλος: Δημοσίευση σε επιστημονικό συνέδριο 1
(με αντικείμενο βιολογίας / βιοχημείας)
Π 3.2 Δημοσίευση σε επιστημονικό συνέδριο 2
(συνέδριο πληροφορικής)
Π 3.3 Δημοσίευση σε επιστημονικό συνέδριο 3
(κλινικό / ιατρικό συνέδριο)
Π 3.4 Δημοσίευση σε επιστημονικό περιοδικό 2
(με αντικείμενο βιολογίας / βιοχημείας)
Π 3.5 Δημοσίευση σε επιστημονικό περιοδικό 2
(με αντικείμενο βιοπληροφορικής)
Π 3.6 Τεχνική έκθεση αποτελεσμάτων ανάλυσης

Ενότητα εργασίας 4

Π4.1 Μελέτη σκοπιμότητας
Π4.2 Σχέδιο βιώσιμης ανάπτυξης
Π4.3 Πολιτική χρήσης

Αποτελέσματα

Η κλινική παθολογία των νευροεκφυλιστικών νόσων υποδηλώνει ότι η πρώιμη έναρξη και εξέλιξη σχετίζεται με τη συσσώρευση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων λόγω εσφαλμένης αναδίπλωσης. Ένας σημαντικός τρόπος εξαγωγής χρήσιμων πληροφοριών σχετικά με μελέτες μεμονωμένων μορίων της λανθασμένης αναδίπλωσης πρωτεΐνης σε νανοκλίμακα είναι η ανάλυση των μοριακών δυνάμεων που αναπτύσσονται μέσω εξαναγκασμένης μηχανικής τάσης που δημιουργείται και μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω φασματοσκοπίας μοριακών δυνάμεων – μικροσκοπίας ατομικής δύναμης (AFM-SMFS). Η συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα τη λήψη δεδομένων με τη μορφή γραφικών παραστάσεων δύναμης έναντι μοριακής επέκτασης (καμπύλες δύναμης-απόστασης), την παροχή πληροφοριών για το υποκείμενο ενεργειακό τοπίο στα διάφορα στάδια δημιουργίας της ελαττωματικής αναδίπλωση και την αξιολόγηση χαρακτηριστικών ελαστικών και κινητικών μοριακών παραμέτρων του πρωτεϊνικού δείγματος.

Το γονίδιο του χρωμοσώματος Χ PLP1 κωδικοποιεί την πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της μυελίνης (PLP), την πιο διαδεδομένη πρωτεΐνη στο περίβλημα της μυελίνης που περιβάλλει το κεντρικό νευρικό σύστημα. Η ανάλυση μέσω εργαλείων πρόβλεψης δομής έδειξε ότι οι περισσότερες από τις παραλλαγές μπορούν να αλλάξουν τη λειτουργικότητα της δομής της πρωτεΐνης και η απώλεια της θερμοδυναμικής σταθερότητας της πρωτεΐνης μπορεί να μειώσει την ικανότητα της δομής να επιτελεί φυσιολογικές λειτουργίες. Η πρόβλεψη για συγκεκριμένες μεταλλάξεις όπως τις L31P, L31V και L31R έδειξε ότι μπορούν οδηγήσουν σε αλλοιωμένη διαμεμβρανική πρωτεΐνική διαμόρφωση ενώ η παραλλαγή R137W παίζει ουσιαστικό ρόλο στη χωροδιάταξη της διαμεμβρανικής πρωτεΐνης. Πραγματοποιήθηκε παράλληλα μελέτη της μοριακής επίδρασης των επιλεγμένων παραλλαγών με τις L31V, L31P L31R να χαρακτηρίζονται από μείωση της σταθερότητας αυξάνοντας ταυτόχρονα τη μοριακή ευελιξία της πρωτεΐνης αγρίου τύπου σε αντίθεση με την παραλλαγή H140Y που ενίσχυσε τη σταθερότητα της πρωτεΐνης.

Παραλλαγή	ΔΔG (kcal/mol)	Αποτέλεσμα	ΔΔSVibENCoM (kcal.mol^-1.K^-1)	Αποτέλεσμα
L31V	-0.133	αποσταθεροποίηση	0.083	αύξηση
L31P	-1.011	αποσταθεροποίηση	0.413	αύξηση
L31R	-0.256	αποσταθεροποίηση	0.231	αύξηση
R137W	-0.400	αποσταθεροποίηση	0.111	αύξηση
H140Y	0.519	σταθεροποίηση	-0.063	μείωση

Ανάλυση διαμόρφωσης της μεταβολής της σταθερότητας της πρωτεΐνης PLP1 κατά την υποκατάσταση αμινοξικών καταλοίπων

Αποτελέσματα Έργου από Επιστημονικές Δημοσιεύσεις

Paplomatas, P., Krokidis, M.G., Vlamos, P., Vrahatis, A.G. An Ensemble Feature Selection Approach for Analysis and Modeling of Transcriptome Data in Alzheimer’s Disease. Applied Sciences 2023, 13, 2353.

Avramouli, A., Krokidis, M.G., Exarchos, T.P., Vlamos, P. In Silico Structural Analysis Predicting the Pathogenicity of PLP1 Mutations in Multiple Sclerosis. Brain Sciences. 2023, 13, 42.

Krokidis, M.G., Efraimidis, E., Cheirdaris, D., Vrahatis, A.G., Exarchos, T.P., Protein Fold Recognition Exploited by Computational and Functional Approaches: Recent Insights. Springer Handbook of Computational Neurodegeneration 2022

Cheirdaris, D. Visualizing Neurodegeneration Using Atomic Force Microscopy. Springer Handbook of Computational Neurodegeneration 2022

Avramouli, A., Krokidis, M.G., Exarchos, T.P., Vlamos, P. Protein structure prediction for disease-related insertions/deletions in Presenilin 1 gene. In GeNeDis 2022, Springer International Publishing in press

Cheirdaris, D., Krokidis, M., Kasti, M., Vrahatis, A., Exarchos, T.P., Vlamos, P. Setting up a bio-AFM to study protein misfolding in neurodegenerative diseases. In GeNeDis 2022 Springer International Publishing, in press

Στοιχεία Υλοποίησης του Έργου

Συμβατική διάρκεια 01/06/2021 – 30/09/2023

Φορέας Υλοποίησης
ΕΙΔΙΚΟΣ ΛΟΓΑΡΙΑΣΜΟΣ ΚΟΝΔΥΛΙΩΝ ΕΡΕΥΝΑΣ ΙΟΝΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ

Επικοινωνήστε με τον υπεύθυνο έργου

Τηλέφωνο: +30 2661087710

Διεύθυνση Email: exarchos@ionio.gr

Διεύθυνση: Πλατεία Τσιριγώτη 7, Κέρκυρα, 49100
Τμήμα Πληροφορικής, Ιόνιο Πανεπιστήμιο, Εργαστήριο Βιοπληροφορικής και Ανθρώπινης Ηλεκτροφυσιολογίας

Το μήνυμα σας υποβλήθηκε με επιτυχία!

Παρουσιάστηκε κάποιο σφάλμα κατά την υποβολή της φόρμας. Επαληθεύστε ξανά όλα τα πεδία φόρμας.